• Різне

    Лабораторна діагностика безсимптомних форм гонореї

    09.10.2015

    Лабораторна діагностика безсимптомних форм гонореї

    На сучасному етапі розвитку медицина стикається з рядом серйозних проблем, пов’язаних з якісними і кількісними змінами інфекційної захворюваності людини. Зокрема, з різким, і, певною мірою, неконтрольованим зростанням випадків інфікування Neisseria gonorrhoae, які лише за опублікованими даними зарубіжних офіційно визнаних наукових видань варіює в межах 14-29,2% у певній залежності від статі хворих (2, 3, 9).

    В основі, як вважають, можуть лежати значне зниження імунореактивності (5), само — та/або неэтиотропное лікування і, звичайно ж, селекція антибіотикостійких особин популяції збудника. Так, показано, що на тлі інтенсивної хіміотерапії in vivo відбувається природний відбір штамів, що відрізняються виключно високим рівнем резистентності. Встановлено, що вже через 3 тижні лікування еритроміцином мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) для штамів N. gonorrhoae, виділених до початку лікування і після закінчення курсу терапії зростає з 1 мг/л до 3 мг/л, а азитроміцину — з 0,125 до 3 мг/л, т.тобто у 24 рази. Це, по ряду публікацій, може носити сполучений характер (4, 11).

    Не виключена ймовірність для N. gonorrhoae існування у вигляді некультивованих форм збудника (1).

    Як можливі наслідки викладеного розглядають зміна характеру симптоматики та збільшення відносного числа атипових, безсимптомних і стертих форм захворювання, особливо серед жінок. Так, інкубаційний період гонореї в даний час у 86,2% випадків перевищує 14 днів, що не узгоджується із загальноприйнятими уявленнями про клініці зазначеного захворювання. Дизурія у хворих фіксується лише в 33-52,8% випадків лабораторно підтвердженої гонореї. У 10,2% захворювання, за літературними даними, протікає при повному відсутності відповідних патогномонічних ознак (6-8, 10).

    Виходячи з вищевикладеного, метою цього дослідження з’явився аналіз випадків безсимптомною, латентної гонореї, і, зокрема, питань, що стосуються зміни морфології збудника і перспектив вдосконалення лабораторної діагностики захворювання.

    МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.

    Проаналізовано 10 випадків (5 жінок і 5 чоловіків), при яких хронічна гонорея була запідозрена анамнестично в одного із статевих партнерів, при абсолютній відсутності у обстежених патогномонічною симптоматики. Вищевикладене послужило підставою для додаткового лабораторного дослідження з включенням в сферу уваги кожного з них.

    Досліджуваний матеріал:

    Зіскрібки зі слизової уретри та піхви, здійснювалися при використанні одноразових зондів (Швеція).

    Світлова мікроскопія (СМ):

    Матеріал наносили на знежирені скла фірми «Ниармедик +» (р. Москва), що відрізняються від звичайних винятковим якістю шліфування і стандартною товщиною пластини, що істотно полегшувало процес фокусування на мікроскопі «ЛЮМАМ Р-1». Збільшення 350-500 разів.

    Препарати фіксували «щадним» хімічним методом, що забезпечує збереження ультраструктури зіскрібка вкрай необхідним при мікроскопічної діагностики хронічних форм патології. Фарбували стандартним методом Грама і метиленової синню в модифікації кафедри мікробіології БДМУ (пропис не розкривається через оформлення відповідної патентної документації).

    Микрофотосъемку здійснювали на кафедрі гістології БДМУ на мікроскопі фірми «Karl Ceiss Iena» (Німеччина) при технічному сприянні доцента кафедри — Мурзабаева Х. Х.

    Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР):

    Верифікацію результатів проводили при використанні техніки ПЛР.

    Забір досліджуваного матеріалу.

    Здійснювався в спеціальні пробірки типу «Eppendorf», що містять відповідну буферну суміш.

    Режим ампліфікації.

      1. Денатурація — 93,0 оС
      2. «Відпал» праймерів — 60,0 оС
      3. Ампліфікація — 72,0 оС

    Кількість циклів — 35.

    Аналіз ДНК.

    10 мкл реакційної суміші після ампліфікації аналізували электрофоретически в 1,5% агарозному гелі. Як маркери використовували ДНК фага ?. рестрицированную Bst E2, і позитивний контроль ДНК N. gonorrhoae. ДНК фарбували бромідом этидия і фотографували при освітленні ультрафіолетовими променями (494 нм) на трансиллюминаторе.

    РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ.

    Зарубіжні літературні дані свідчать, що навіть при хронічній гонореї виявлення збудника в мазках-препаратах може досягати 81,1%, але істотно залежить від виду досліджуваного матеріалу, значно знижуючись, наприклад, при аналізі ректальних проб (3).

    В результаті проведеного нами порівняльного вивчення клінічних зразків були встановлені 2 основних морфоварианта (Рис.1 і Рис.2), що спостерігаються при світловій мікроскопії мазків жінок (Рис.1) і чоловіків (Рис.2).

    При цьому показано, що у жінок в 3 з п’яти випадків мікроскопічно виявлялася картина бактеріального вагінозу (БВ), практично виключала можливість візуальної детекції диплококков (Рис.1) зважаючи на велику кількість супутньої грамвариабильной бактеріальної флори. Це з одного боку могло бути пов’язано зі значним зниженням природної резистентності слизової оболонки, а з іншого боку — з пригніченням життєздатності патогенів гнильної флорою через їх високої фізіологічної залежності від організму господаря, що лежить в основі здатності збудника до факультативного внутрішньоклітинного паразитування.

    Лабораторна діагностика безсимптомних форм гонореї

    Рис.1. Мікроскопічна картина БВ (збільшення х 350)

    Порівняльна характеристика проб, пофарбованих різними способами, у процесі їх світлової мікроскопії показала повну непридатність в аналізованих випадках методу Грама, оскільки робила практично неможливою диференціацію грампозитивних і грамнегативних бактерій. Пояснення зазначеного, на наш погляд, слід шукати в тому факті, що мікроорганізми, що заселяють певну екологічну нішу в природних умовах належать до різних «віковим» групам. У цьому випадку клітинна стінка бактерій, включаючи пептидоглікан, знаходиться на різних етапах формування і не завжди містить хімічні речовини необхідні для міцного їх зв’язування з генцианвиолетом та/або фуксином. У зазначених випадках також необхідно враховувати тиск на мікроб зовнішніх факторів (антибіотики, дезінфектанти, гормональний фон хворого, рівень його імунореактивності і. д.), кожен з яких може суттєво змінити фізіологічний та морфологічний стан збудника.

    Запропонована нами модифікація методу фарбування метиленової синню дозволяла диференціювати грамвариабельные форми бактерій, очевидно завдяки участі у фарбуванні інших хімічних груп, що вимагає, однак, подальшого наукового осмислення.

    Лабораторна діагностика безсимптомних форм гонореї

    Рис.2. Мікроскопічна картина мазка хворий хронічної атиповою формою гонореї, верифицированной методом ПЛР (збільшення х 350).

    Вважається, що при хронічній гонореї інформативність СМ підвищується тільки в період рецидиву захворювання або ж при суперинфицировании хворого. Разом з тим, проведені нами дослідження показали, що виявлення диплококков може бути пов’язана з адекватністю сприйняття виявляються фактів. Так у 7 з 10 випадків мікроскопічно встановлено картина, не вкладається в рамки загальноприйнятих уявлень про пейзаж мазків, що виявляються при СМ у хворих навіть хронічними формами гонореї (Рис. 2), оскільки в жодному з них ми не виявили «звичного», з точки зору вітчизняної літератури, лейкоцитозу. У всіх 7 позитивних СМ по зразках збудник, не маючи чіткої бобовидной форми, був оточений потужної капсулою, порівнянною з розмірами клітини в цілому, диференціювався як грамнегативний, присутній практично в чистій культурі, але відрізнявся меншими (в 2 і більше рази) розмірами. Це вимагало збільшення роздільної здатності мікроскопа (не менше х350-500 разів), створюючи одночасно проблеми, пов’язані з необхідністю підвищення інтенсивності освітлення.

    Лабораторна діагностика безсимптомних форм гонореї

    Рис.3. Фотознімок агарозного гелю з результатами ПЛР за ампліфікації специфічних фрагментів ДНК N. gonorrhoae (Банди 1-4 (ДНК фага l і N. gonorrhoae — позитивні контролі, банди 5-14 — досліджені зразки).

    Викладені вище дані, тим не менш, не дозволили нам робити серйозні наукові узагальнення, і послужили мотивацією до верифікації отриманих результатів при використанні найсучаснішого методу діагностики — полімеразної ланцюгової реакції. Здійснений у відповідності з вимогами забір досліджуваного матеріалу і підготовка зразків дозволили нам відкоригувати початкові результати і додатково виявити випадок хронічної гонореї у ситуації, коли мікроскопічно відповідний результат нам зафіксувати не вдалося навіть після відповідних провокують впливів. При цьому, завдяки ПЛР псевдонегативний результат був виключений у жінки навіть на тлі БВ, коли вірогідність діагностичної помилки найбільш висока. Більш того, було показано, що метод застосуємо для виявлення атипових і, можливо, некультивованих форм збудника, що є найбільш частими при хронічних і атипових формах інфекційного процесу. Це робить його незамінним на етапі контролю излеченности і вимагає більш широкого впровадження завдяки виключно високій чутливості.

    Таким чином, при дослідженні клінічного матеріалу в одній з обстежених пар лабораторний діагноз був знятий, тоді як у чотирьох випадках методом ПЛР результат був підтверджений в обох статевих партнерів на тлі відсутності відповідної симптоматики.

    Резюмуючи вищевикладене, слід укласти, що гонорея у сучасних умовах перетерпіла істотні зміни, обумовлюючи виникають на практиці складності діагностики зазначених форм патології людини, а як наслідок цього — проблеми з здійсненням етіотропної терапії. У цьому зв’язку виникає необхідність перегляду діагностичних підходів в плані вдосконалення традиційних методів та запровадження нових, також зміни ставлення до отримуваних лабораторними даними у процесі їх інтерпретації.

    БВ повинен розглядатися як фактор, що визначає вірогідність діагностичних помилок.

    Мікроскопічно продемонстрована специфіка морфологічної картини, яка виникає при підозрі на хронічну гонорею.

    Полімеразна ланцюгова реакція забезпечує об’єктивний результат при атипових і хронічних формах гонореї.

    Короткий опис статті: лабораторна діагностика Перспективи методу лабораторної діагностики безсимптомних форм гонореї. Як виявити безсимптомну гонорею гонорея, діагностика гонореї, безсимптомна гонорея

    Джерело: Лабораторна діагностика безсимптомних форм гонореї

    Також ви можете прочитати