Основні методи лабораторної діагностики хламідійної інфекції кішок

03.10.2015

Основні методи лабораторної діагностики хламідійної інфекції кішок

Гончаров С. Б.

Ветеринарний лікар

В останнє десятиліття інтерес медичних і ветеринарних фахівців багатьох країн світу привертають хламідії, які широко поширені серед різних видів тварин, що обумовлено наявністю неконтрольованого резервуару збудника інфекції в природі.[6] Хламідії здатні викликати захворювання більш ніж у 200 видів ссавців, а також у птахів і рептилій. Заражені тварини можуть стати джерелом інфекції людини.[10, 24] Таким чином, хламідіоз є зооантропонозом, тобто інфекційною хворобою загальної для людини і тварин.

Патологія, що викликається хламідіями, досить різноманітна. У птахів зустрічаються респіраторна, энтеральная і генералізована форми.[15] У ссавців захворювання проявляються у вигляді ензоотичних абортів, плацентитов, вагінітів і поліартритів.[3, 31] У людини ці мікроорганізми викликають більше 20 клінічних синдромів, зокрема, фарингіти, отити, бронхопневмонії, міокардити, артрити, ураження нервової системи та очей, а також венеричні гранульоми та урогенітальні поразки.[5, 6, 7, 8] Дослідження, проведені в багатьох країнах протягом останніх десяти років, показали, що серед домашніх тварин – хламідіоз, в клінічно вираженій формі, найчастіше зустрічається у кішок.[16, 17]

Збудники хвороби – Chlamydophila psittaci і Chlamydophila felis. Вони відносяться до одного з маловивчених груп мікроорганізмів. Особливістю хламідій є здатність при несприятливих умовах (некоректна терапія та ін.) трансформуватися в латентні (L) форми, що супроводжується тривалою персистенцією збудника і хронічним перебігом хвороби. Це створює серйозні труднощі в діагностиці та лікуванні захворювання, так як L-форми хламідій не чутливі до антибіотиків і важко діагностуються.[22] В латентній формі ці збудники дуже стійкі до хімічних і фізичних впливів, в активній формі на них згубно діють УФЛ, кип’ятіння, 700C етиловий спирт та інші дезинфікуючі засоби.[14, 20, 43]

Часто небезпека зараження людини хламідіозом виходить від птахів, особливо від папуг і голубів. Штами хламідій, виділені від птахів, вважаються для людини особливо патогенними. Зараження відбувається аерогенним шляхом за рахунок вдихання пилу, що містить у зваженому стані виділення і частинки пір’я птахів, інфікованих хламідіями.[15, 27, 40]

У 1980-му році були описані 20 випадків зараження людини хламідіями від ссавців. Кішки заражаються майже всіма штамами збудника. Птахи і миші, на яких вони полюють, є природним резервуаром і первинним джерелом інфекції. Зараження людини відбувається при тісному контакті з кішкою, у якій інфекція може протікати латентно.[33]

Етіологічна роль котячих хламідій поки до кінця не з’ясована, хоча в літературі є приклади зооантропонозной природи цієї інфекцій. Так, у США двадцятирічний чоловік захворів одностороннім фолікулярний кон’юнктивіт після того, як у його кішки виявилися симптоми ураження кон’юнктиви. Як у кішки, так і у її господаря в конъюнктивальных мазках, узятих у цих випадках, були знайдені тільця-включення, типові для хламідій. Вважають, що антиген від кішки до людини потрапив через завдані котячі подряпини.[2]

згідно з рішенням юридичної комісії Міжнародної асоціації мікробіологічних товариств (МАМО), з 1980р. ці мікроорганізми отримали родове назву Chlamydia. До 1989р. були відомі тільки 2 види хламідій — C. trachomatis i C. psittaci. З 1989р. виділяють третій самостійний вид хламідій — C. pneumoniae, а в 1993р. японськими мікробіологами описаний і четвертий вид — C. pecorum (Fukushi Н. Hirai К. 1993). За новою класифікацією мова йде про патогенних для людини мікроорганізмів Chlamydia trachomatis, серовар D-K, що належать до роду Chlamidia. До цього ж роду відноситься також вид C. muridarum, патогенний для мишей і хом’яків, і вид C. suis, що інфікує свиней.[24, 33]

Хламідії є грамнегативними бактеріями. Вони мають схожу з бактеріями клітинну стінку, їх генетичний апарат представлений нуклеїнових кислот – ДНК і РНК, чутливі до антибіотиків, що зближує їх з грамнегативними бактеріями.[32] Однак вони не здатні розмножуватися на штучних живильних середовищах, і для розмноження їм потрібна жива чутлива клітина як внутрішньоклітинних мікроорганізмів, що ріднить їх з вірусами.[41]

Хламідії мають здатність блокувати механізми імунного захисту господаря шляхом запобігання злиття фагосомы з лизосомами. Завдяки цьому клітини господаря не тільки оберігають инфект, але і сприяють їх зростанню. Для розмноження і росту внутрішньоклітинні патогени використовують поживні речовини і продукти життєдіяльності клітини-господаря. У процесі свого розмноження хламідії руйнують цитоплазматичні включення, виходять з клітини-господаря в зовнішнє середовище і заражають нові клітини.[12]

Патогенез хламідійної інфекцій може бути представлений у вигляді наступної схеми: хламідії є облігатними внутрішньоклітинними паразитами, володіють високим политропизмом. Проникнувши в організм аерогенним, аліментарним або статевим шляхом, збудник первинно розмножується в епітеліальних клітинах слизових оболонок і макрофагах. Потім проникає в кров і заноситься практично на всі внутрішні органи, лімфатичні вузли, суглоби і навіть в головний і спинний мозок.[30]

Природний цикл розвитку хламідій проходить в цитоплазматичних включеннях живих клітин (елементарне тільце ® ретикулярное тільце ® ретикулярні тільця ® проміжні тільця ® елементарні тільця) і триває від двох до трьох діб. Елементарні тільця відповідальні за процес прикріплення до клітини-мішені і проникнення в неї. Вони стійкі до чинників навколишнього середовища. Дрібні і оптично щільні елементарні тільця мають ригидную клітинну стінку, жорсткість структури якої забезпечується щільними дисульфідними зв’язками основного білка зовнішньої мембрани і двома багатими цистеїном білками: білком оболонки і ліпопротеїдом зовнішньої мембрани. Ретикулярні тільця – це великі, метаболічно активні форми, які синтезують ДНК, РНК і білки. Ретикулярні тільця є високо лабільними формами, які не здатні вижити поза клітини-господаря.[42]

Хламідії виявляють виражену чутливість до дії короткохвильових і довгохвильових ультрафіолетових променів і високої температури. Елементарні тільця втрачають свою інфекційність у 24-36 годин при 370С. Концентрована суспензія хламідій інактивується протягом 1 хв. при 95-1000С, через 10-15 хв. при 700С, через 30 хв. при 500С.

Встановлена можливість збереження інфекційності матеріалу на бавовняних тканинах до 2 діб при 18-190С.

Хламідії на стадії ретикулярних тілець високочутливі до дії 70% етанолу, 2% розчин лізолу, 0,05% розчину нітрату срібла, 0,1% розчину йодиду калію, 0,1% розчину перманганату калію, перекису водню, етилового ефіру та інактивуються при кімнатній температурі протягом 2 діб.[35]

Активна форма хламідіозу кішок – висококонтагіозна полисимтоматическая хвороба, що виявляється, найчастіше, загальною слабкістю, скутістю рухів, підвищеною температурою тіла, кон’юнктивітом, ринітом, задишкою, гастритом, ендометритом, вагинитом. Рідше зустрічаються ураження інших органів і систем. При урогенітальної локалізації хламідії викликають аборти, мертвонародження і безпліддя. Хламідіоз найбільш часто вражає кошенят у віці від 5-ти тижнів до 9-ти місяців. Дорослі тварини також можуть заражатися, оскільки природний імунітет не тривалий, має не високу напруженість. Велика ймовірність повторного зараження, так як гуморальні антитіла, циркулюючі в крові, не можуть захистити організм від реінфекції.[16]

Інкубаційний період триває від 5 до 10 днів. На початку захворювання зазвичай відзначають легку лихоманку, що триває кілька днів. Хворі кішки зазвичай продовжують приймати корм і, як правило, почувають себе добре, виявляючи лише кон’юнктивальний дискомфорт. Кон’юнктивіт починається в більшості випадків унилатерально (одностороннє), виділення з ока – серозні. Через 10 – 17 днів уражається друге око. Кон’юнктивіт може тривати від кількох днів до кількох місяців, а іноді приймає хронічне протягом. У міру розвитку хвороби кон’юнктива стає гиперемированной, а виділення слизисто-гнійними внаслідок вторинної бактеріальної інфекції.[38]

Поразка дихальних шляхів часто проходить безсимптомно або з слабко вираженими ознаками. Тому діагностувати хламидиозную пневмонію можна тільки гістологічними методами. Вогнища ураження легеневої тканини у вигляді дрібних обмежених гиперемированных ділянок зі слабкою аерацією, розташовуються переважно в периферичних ділянках легені поруч з бронхиолами.

Порушення репродуктивної функції у кішок, включаючи аборти, відзначалися досить часто в котячих розплідниках, де спостерігається ендемічне перебіг хвороби.

Впровадження хламідій у сечостатевої тракт рідко супроводжується помітними клінічними проявами. Захворювання частіше буває асимптомним або прихованим.

Діагностика хламідіозу кішок утруднена, оскільки багато клінічні ознаки притаманні іншим захворюванням – калицивирусной і реовірусної інфекції.[17]

Ані один із сучасних методів діагностики внутрішньоклітинних патогенів не забезпечує виявлення збудника в 100% випадків. Тому лабораторна діагностика хламідій повинна включати в себе поєднання не менше двох методів (прямих або непрямих).[23]

1. Методи прямого виявлення бактерій:

· Мікробіологічне дослідження – виділення чистої культури збудника;

· Цитологічне дослідження мазків, пофарбованих за методом Романовського-Гімза;

· Імунологічне дослідження – виявлення антигенів збудника в мазках за допомогою специфічних антитіл (реакція прямої імунофлуоресценції – РИФ), ДНК-зонди;

· Молекулярно-біологічні методи – визначення специфічної ділянки ДНК/РНК в геномі збудника (полімеразна ланцюгова реакція – ПЛР, лигазная ланцюгова реакція – ЛЦР);

· Серологічне дослідження – визначення бактеріальних антигенів (імуноферментний аналіз – ІФА);

· Методи експрес-діагностики хламідій (иммунохроматография і ферментспецифическая реакція).

2. Непрямий метод, побічно вказує на наявність збудника у пацієнта:

· Серологічне дослідження – визначення специфічних антитіл, що утворилися в процесі імунної відповіді на мікроорганізм (реакція зв’язування комплементу – РСК, реакція непрямої імунофлуоресценції – РНІФ, імуноферментний аналіз – ІФА, реакція микроиммунофлуоресцинции – МІФ, рекомбінантний ліпополісахарідной ІФА – r-ELISA).[1, 18]

Методи прямого виявлення хламідій.

Найбільш чутливим, але трудомістким методом лабораторної діагностики є мікробіологічне дослідження. Для розмноження in vitro хламідій необхідні клітинні лінії ссавців. Для цієї мети використовують культуру клітин McCoy представляє собою гібридні клітинні лінії з людських синовіальних клітин і мишачих фібробластів, а також клітини Hela – перманентну клітинну лінію з людської карциноми і L-299 – культуру клітин мишачих фібробластів.

Для C. psittaci найбільш ефективно застосовують перманентну клітинну лінію з нирок африканської зеленої мавпи (BGM), в той час як для C. trachomatis клітини McCoy.

Критерієм діагностичного виділення хламідій служить виявлення в інфікованих клітинах типових цитоплазматичних включень в забарвлених препаратах при первинному зараженні або у серії 1-2 пасажів при відсутності бактеріальної контамінації.

При мікробіологічному методі дослідження можливе отримання помилково-негативних результатів. Це відбувається внаслідок загибелі збудника при порушенні правил забору біологічного матеріалу або під час його транспортування в мікробіологічну лабораторію.

Цитологічний метод – метод безпосередньої мікроскопії — патологічного матеріалу (зіскрібок з ураженої слизової оболонки) був основним способом виявлення хламідій. При цьому використовували забарвлення препаратів за Стемпу, Маккиавелло і Романовському-Гімзе. Забарвлення за Стемпу надає елементарним тельцям хламідії червоно-фіолетовий колір на синьому тлі препарату; по Маккиавелло хламідії забарвлюються в яскраво-червоний колір, клітини патологічного матеріалу – у світло-синій, ядра клітин – в темно-синій колір; по Романовському-Гімзе елементарні включення хламідії набувають червоно — фіолетовий колір, а ретикулярні тільця ураженої клітини – синій, ядро клітин – бордово-фіолетовий і їх цитоплазма – блакитний. Пофарбовані мазки досліджують з імерсійної системою. Клітинні включення при мікроскопії знаходять у вигляді скупчення в цитоплазмі навколо ядра ураженої клітини і утворюють компактні включення у формі шапочки жандарма». Включення можуть розташовуватися в цитоплазмі клітини дифузно. Цитологічний метод в останній час практично не використовується, у зв’язку з низькою чутливістю – діагностувати хламідійну інфекцію у хворих тварин вдається лише в 10-12% випадків.[18]

Одним з найбільш поширених методів діагностики є метод імунофлуоресценції, що дозволяють виявити цитоплазматичні включення хламідій з містяться в них антигенами.

Прямий метод імунофлуоресценції заснований на виявленні хламідійних антигенів в клінічних зразках від тварин з допомогою ліофілізованих моноклональних антихламидийных імуноглобулінів, мічених флуоресцин-изотиоционатом (ФІТЦ), з синькою Еванса і азидом натрію.

Висока специфічність моноклональних антитіл дозволяє діагностувати наявність елементарних тілець хламідій, розташованих внеклеточно і представляють собою яскраво-зелені освіти з рівними краями округлої форми. Розміри їх складають 1/100 від оточуючих епітеліальних клітин.

У непрямому методі передбачається непряме фарбування антигену, який з’єднується на першому етапі реакції з немеченой антисывороткой тварини, свідомо містить хламідійні антитіла, а на другому етапі проводиться фарбування утворився комплексу антиген-антитіло за рахунок додавання меченной (антивидовой) сироваткою, що містить кон’юговані з ФІТЦ антитіла до глобулінів (антигенів) сироватки, що використовувалась на першому етапі.

Отримання хибно-негативних матеріалів може бути пов’язано з порушення правил забору біологічного матеріалу (відсутність епітеліальних клітин в мазку). Хибно-позитивні результати є наслідком неспецифічного зв’язування антитіл з неінфекційним біоматеріалом.

Метод полімеразної ланцюгової реакції (polimerase chain reaction, PCR, ПЛР) або реакція ензиматичної амплификаций, запропонована Кері Б. Мюллисом (1983), стрімко увійшов у практику і роботу вчених, провідних дослідження в області біології та медицини. ПЛР широко застосовується для діагностики та типування збудників хламидиозов, що пов’язано зі складністю їх культивування.[19]

Переваги ПЛР:

а) Швидкість аналізу. Всі процедури ПЛР займають 1-2 робочих дні при паралельної обробки 10-12 зразків;

б) Надійність;

в) Чутливість;

г) Специфічність;

д) Для ПЛР придатний будь-який матеріал, навіть гистопрепараты.

Основні компоненти ПЛР:

а) термостабільний фермент ДНК-полімеру;

б) пари олігонуклеотидних праймерів;

в) чотири типи дезоксинуклеозидтрифосфатов;

г) копируема ДНК;

д) іони Mg2+ необхідні для функціонування ДНК-полімерази;

е) буферні розчини для підтримки рН під час ПЛР між 6,8 – 7,8 і мінеральне масло для запобігання випаровування.

Ампліфікатор – це прилад для проведення реакції в автоматичному режимі, що забезпечує підтримку в реакційній суміші заданої температури протягом заданого часу.

Технологія ідентифікації ДНК-вмісних вірусів полягає в наступному:

1) З досліджуваного матеріалу виділяється ДНК-матриця

2) В пробірці змішують ДНК, праймери, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер і ДНК-полімеразу

3) Пробірку з сумішшю нагрівають до температури денатурації ДНК (940С), при цьому два ланцюги ДНК розходяться

4) Потім пробу інкубують при температурі гібридизації праймерів з ДНК-матрицею (40-600С) у подальшому

5) ДНК-полімераза здійснює комплементарне добудовування ниток ДНК-матриці з допомогою дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (720З). У результаті проведеного циклу відбувається подвоєння потрібного генетичного матеріалу

6) У наступному циклі синтез здійснюється з 4 копій, далі з 8 і т. д. до 20-30 циклів. В результаті отримують мільйони копій специфічної ділянки ДНК вірусів, бактерій або клітин крові.

Індикація амплифицированного генетичного матеріалу проводиться вище викладеним способом. В ПЛР будь-знову синтезованих ланцюгів ДНК служить матрицею для синтезу молекул ДНК, які відповідають за довжиною і послідовності ділянки ДНК, обраному для ампліфікації.[34]

Підготовка проби матеріалу (виділення ДНК і РНК) повинна проводитися в умовах, що виключають перехресне забруднення досліджуваних проб виділяються нуклеїновими кислотами. Для цього необхідно використовувати чисті рукавички, одноразові пробірки і наконечники до автоматичних пипеткам, УФЛ і 700C спирт для обробки приміщень і робочих поверхонь столів і приладів.[13]

Незважаючи на зростаючу популярність методу ПЛР він також, як і ПІФ бездоганний, оскільки при використанні високочутливої і специфічної ПЛР не виключені хибнопозитивні і помилково негативні результати. Якщо C. psittaci виявлена методом ПЛР, то можна обмежиться тільки цим дослідженням. Думка, що ПЛР навіть при дотриманні всіх технологічних вимог дає позитивні результати внаслідок контамінації в лабораторії, не підтверджується практикою, хоча були випадки, коли ПЛР давала позитивний результат, а ПІФ – негативний. Саме такі випадки відносяться до ситуацій так званого «суб’єктивного характеру обліку результатів, отриманих методом імунофлуоресценції.

Для виявлення хламідій у досліджуваному матеріалі можна застосувати иммуноэнзимный метод (ELISA). При цьому використовують антитіла, кон’юговані з ферментом (пероксидаза хрону, лужна фосфатаза та ін). При наявності в досліджуваному матеріалі хламідій, тобто позитивна реакція антиген-антитіло, вивільняється фермент, який діє на спеціально вводиться в реагуючу суміш субстрат. Утворюється кольорове з’єднання і по інтенсивності кольору, обумовленого за допомогою спектрофотометра, судять про кількість і наявність антигену в забранном матеріалі (мазку, зіскобі). Иммуноэнзимный аналіз, як і реакція прямої імунофлуоресценції, може дати позитивний результат при наявності в забранном матеріалі нежиттєздатних хламідій, а також інших бактерій, що мають перехресно реагують на антигени (деякі грамнегативні бактерії, рикетсії Провачека і ін). Помилково-негативні результати є наслідком низької концентрації антигену в досліджуваних зразках. Причиною хибно-позитивних результатів може бути неспецифічне зв’язування антитіл з неінфекційним біоматеріалом.[18, 34]

Методи непрямого виявлення хламідій.

Ця група методів дозволяє уникнути хибнонегативних результатів при прямих методах і дозволяє в ряді випадків визначити стадію і характер перебігу захворювання. Це особливо важливо при персистуючої інфекції, яка підтримує хронічне протягом протягом багатьох місяців, ушкоджуючи і руйнуючи тканини і органи. Методи непрямого виявлення бактерій особливо гарні, якщо виникають труднощі при взяття матеріалу для виявлення антитіл.

У основі цих методів лежить виявлення специфічних антитіл, які накопичуються в сироватці крові та секретах інфікованого організму, в процесі імунної відповіді на впровадження збудника інфекційного захворювання. Антитіла відносяться до трьох класів імуноглобулінів: M, G, A. Накопичення антитіл кожного з цих класів відбувається через різні проміжки часу від початку імунної відповіді і залежить від характеру інфікування (первинне або повторне) [1, 6].

Реєстрацію специфічних антитіл можна проводити одним з імунохімічних методів. Найбільш ефективним є методи микроиммунофлуоресцинции і рекомбінантного липополисахаридного ІФА, які не вимагають великої кількості біологічного матеріалу і дозволяють досить точно визначити до якого класу належать антитіла. За допомогою цих методів вдається встановити діагностичні критерії та стадії захворювань.

Негативний результат серологічного дослідження не дозволяє однозначно виключити хламідіоз, так як крім серопозитивних зустрічаються і серонегативна форми цієї інфекції. Виявлення в крові тільки IgG до C. psittaci навіть у високому титрі при відсутності маркерів самого збудника в урогенітальному тракті не є підставою для встановлення діагнозу. І навпаки, виявлення IgA до C. psittaci – підстава для постановки діагнозу хламідіозу. Принципового значення величина титру цих антитіл (IgA) і наявність або відсутність маркерів самих хламідій в урогенітальному тракті не має.[18,19,39]

Короткий опис статті: основні методи лабораторної діагностики Гончаров С. Б Статті про медицину, медикаменти, аптеки, поліклініки, лікарі, відгуки, Основні методи лабораторної діагностики хламідійної інфекції кішок, Медичний портал — клініки

Джерело: Основні методи лабораторної діагностики хламідійної інфекції кішок — Статті про медицину — Медичний портал — клініки, медикаменти, лікарі, відгуки

Також ви можете прочитати